Die Hauptkirche St. Nikolai wurde 1956 aus der City an den Klosterstern im Stadtteil Harvestehude verlegt. Zunächst versammelte sich die Gemeinde in einem Konzertsaal, den ein Pianist nach dem 2. Weltkrieg an seine Villa am Harvestehuder Weg 91, dem heutigen Kinderhaus St. Nikolai, angebaut hatte. Schon im Januar 1957 wurde eine Kantorei unter Kirchenmusikdirektor Walter Gebhardt gegründet, die ihre Konzerte zunächst reihum in den vier anderen Hauptkirchen geben musste. Erst 1960 wurde nach den Plänen von Gerhard Langmaack der Grundstein für die neue Hauptkirche St. Nikolai am Klosterstern gelegt, die am 30. September 1962 in Anwesenheit des damaligen Hamburger Innensenators Helmut Schmidt durch Bischof Witte eingeweiht wurde.

Schon Jahre vorher hatte der Kindergarten St. Nikolai in einer Villa am Harvestehuder Weg seine Arbeit fortsetzen können, die schon 1926 am Hopfenmarkt begonnen hatte. (Diese Villa musste später dem Neubau der Kirche weichen.) Im August 2004 wurde im Hause Oderfelder Straße 17 ein zusätzlicher Kindergarten geschaffen.

Mit der Wahl von Hauptpastor Dr. Hans-Otto Wölber zum Bischof der damaligen Ev.-Luth. Kirche im Hamburgischen Staate wurde die Hauptkirche St. Nikolai im Jahre 1964 auch Bischofskirche und blieb dies bis 1987.

1964 konnte die Hauptkirche St. Nikolai die Villa Abteistr. 38 erwerben, die fast vierzig Jahre lang als einziges Gemeindehaus diente. 2003 sorgte ein zusätzliches Gemeindehaus, gebaut nach den Entwürfen von Carsten Roth, für Entlastung.

In Ermangelung eines Gemeindesaals fanden bis 2003 auch alle Vortragsveranstaltungen in der Kirche statt. Sie tragen bis heute die Bezeichnung „Kanzeln“.

1987 wurde unter Federführung von Propst und Hauptpastor Klaus Reinhold Borck das Evangelische Laienzentrum St. Nikolai im Kirchenkreis Alt-Hamburg gegründet, das nach zehn Jahren in der Arbeit des „DreiF-Werks“ (Freiwillige Fördern Fortbilden) des Kirchenkreises Alt-Hamburg aufging. Seit 1992 besteht die Hamburger Seniorenakademie an der Hauptkirche St. Nikolai, die im Akademischen Jahr 2005/2006 ca. 2.500 Senioren aus ganz Norddeutschland erreichte.

1994 wurde auf Initiative von Hauptpastor Dr. Ferdinand Ahuis das Projekt „Die Hamburger Kinderbischöfe“ ins Leben gerufen, die, anknüpfend an eine mittelalterliche Tradition, die unantastbare Würde des Kindes repräsentieren und mit unterschiedlicher Thematik Sprachrohr für die Bedürfnisse von Kindern in der Großstadt Hamburg sind.

1995 konnte die Hauptkirche St. Nikolai auf eine 800jährige Geschichte zurückblicken. Im Jahr 1195 war auf Veranlassung des Grafen Adolf III. von Schauenburg, Graf von Holstein und Stormarn, außerhalb der alten Hamburger Stadtbefestigung, in unmittelbarer Nähe der „Neuen Burg“ und mit Blick auf den sich entwickelnden Hafen an Alster und Elbe, der Grundstein für eine Kapelle gelegt worden, die ein Zeichen setzte für das damals moderne Hamburg und gleichzeitig für ein selbstbewusstes Hamburger Bürgertum. Die Kirche wurde St. Nikolaus geweiht, dem Patron der Kinder, der Seefahrer und Reisenden, der Bäcker und Kaufleute und nicht zuletzt der jungen Frauen. Nach dem Dom und der Petri-Kirche stellte sie die dritte der Hamburger Stadtkirchen dar und ist jetzt zweitälteste der Hamburger Hauptkirchengemeinden.

2004 wurde das Dietrich-Bonhoeffer-Studien- und Begegnungszentrum in Sczcecin (Stettin) seiner Bestimmung übergeben, das zu einem erheblichen Teil mit Spendengeldern von Gemeindegliedern der Hauptkirche St. Nikolai in einer Villa aus dem Anfang des 20. Jh. entstanden war.

Im Frühjahr 2006 wurde ein von St. Nikolai unterstützter Wiederaufbau eines Kindergartens in Sri Lanka abgeschlossen, dem die Wiederherstellung einer Schule folgen soll.

Im August 2006 wurde die Evangelische Grundschule St. Nikolai ihrer Bestimmung übergeben, der ersten Nikolai-Schule nach der gleichnamigen bis 1906 existierenden Schule, 1529 von Johannes Bugenhagen neu geordneten Schule aus dem Jahre 1281.

In der Reformationszeit wird St. Nikolai zum Schrittmacher eines liberalen Luthertums, dem jede Orthodoxie fremd blieb. Zwar wurde Johannes Bugenhagen, der 1524 von der Gemeinde St. Nikolai zum ersten Hauptpastor gewählt worden war, durch den Senat nicht in seinem Amt bestätigt. Aber 1528 kehrte Bugenhagen nach Hamburg zurück und gab der Stadt 1529 eine Kirchenordnung, mit welcher er Organisation, speziell die soziale Organisation, Finanzen und z.B. den Schulbetrieb sowie die bürgerliche Mitbestimmung in der Stadt regelte. Der „Gotteskasten“, zunächst nichts anderes als eine stattliche Truhe mit einem Schlitz im Deckel für den Einwurf von Geld, war der Anfang der Hamburger Sozialbehörde. Schon früh, im Jahre 1527, war der Gotteskasten in St. Nikolai, zur Versorgung der Armen im Kirchspiel eingeführt worden – ein Zeichen dafür, dass Bugenhagen mit seiner Kirchenordnung das aufnahm, was Hamburger Bürgersinn schon eingeführt hatte. In St. Nikolai gab es sogar einen zweiten Gotteskasten für den Finanzausgleich zwischen den damals noch vier Hamburger Hauptkirchen.

Von sich Reden machte St. Nikolai durch den Pietismusstreit um Hauptpastor Johann Heinrich Horb(ius), einen Schwager des Pietisten Philipp Jakob Spener und vehementen Verteidiger von dessen pietistischen Schriften. Horb war 1684 zum Hauptpastor an St. Nikolai gewählt worden, obwohl das von der Theologischen Fakultät in Straßburg erbetene Gutachten über seine Lehre nicht günstig lautete. Im Frühjahr 1685 trat er das neue Amt an und entfaltete eine ausgedehnte und erfolgreiche Wirksamkeit, hatte aber auch von Anfang an viele Widersacher. Von den fünf Hauptpastoren waren Samuel Schultz (St. Petri) und Johann Friedrich Mayer (St. Jacobi) entschiedene Gegner des Pietismus, während Johannes Winckler (St. Michaelis) und Abraham Hinckelmann (St. Katharinen) auf Horbs Seite standen. Am Silvesterabend 1692 verteilte Horb das Büchlein „Die Klugheit der Gerechten, die Kinder nach den wahren Gründen des Christentums von der Welt zu dem Herrn zu erziehen“. Die Herausgabe und Verbreitung dieser Schrift durch Horb veranlassten den St. Jacobi-Hauptpastor Mayer in seinem Hass gegen Spener, gegen Horb einen heftigen Streit zu entfachen, der auf der Kanzel und in etwa 200 kleineren und größeren Schriften erbittert geführt wurde und damit endete, daß in einer tumultuarischen Versammlung der Bürgerschaft am 24.11.1693 beschlossen wurde, daß Horb abgesetzt werden und die Stadt und ihr Gebiet verlassen solle. Horb zog sich nach Schleems, einem holsteinischen Ort im Kirchspiel Steinbeck, zurück. Obwohl das Kirchenkollegium zu St. Nikolai Horbs Absetzung nicht anerkannte, gelang es doch nicht, ihn wieder in sein Amt zurückzuführen.

Das 19. Jh. war geprägt durch die Zerstörung der spätgotischen, barock umgestalteten Hauptkirche St. Nikolai am Hopfenmarkt während des Hamburger Brandes von 1842 und den Neubau einer neugotischen Kirche nach den Plänen des englischen Architekten Gilbert Scott von 1846 bis 1874. Der Turm ist mit 147,2 m der höchste Kirchturm Hamburgs und der vierthöchste der Welt und Ausdruck des Hamburger Bürgersinns, der den aufwändigen Neubau der Kirche möglich machte.

Im Jahre 1892 wurde Eduard Grimm Hauptpastor von St. Nikolai. Von 1894 bis 1920 war er Mitglied des Kirchenrates, ab 1895 war er für die Kandidatenbibliothek zuständig, der er viele seiner eigenen Werke schenkte. Grimm war ein liberaler Theologe und Mitglied des Protestantenvereins. Darüber hinaus gehörte er dem Allgemeinen evangelisch-protestantischen Missionsverein an. 1897 erhielt Grimm die theologische Ehrendoktorwürde der Universität Jena. 1911 wurde er zum Senior der Evangelisch-lutherischen Kirche im Hamburgischen Staate gewählt. Grimm war als Vertreter der Evangelisch-lutherischen Kirche im Hamburgischen Staate Mitglied der Deutschen Evangelischen Kirchenkonferenz, des Deutschen Evangelischen Kirchentages (1919-1921) und bis 1920 des Ersten Deutschen Evangelischen Kirchenausschusses. Während seiner Amtszeit arbeitete er am liturgischen Handbuch und an der Neuausgabe des Gesangbuchs mit. Er gründete die erste Gemeindepflege auf Hamburger Boden in St. Nikolai. Mittelpunkt seiner Verkündigung war die Heiligkeit des Sittengesetzes und die letzte Verantwortung vor diesem Sittengesetz; hier erfüllte sich für ihn die Würde des Menschen. Wissenschaftlich arbeitet Grimm insbesondere auf philosophischem, später mehr auf theologischem und religionswissenschaftlichem Gebiet. Er publizierte über französische und englische Philosophie des 17. und 18. Jahrhunderts (Empirismus, Okkasionalismus), über Kant und Nietzsche sowie über Religionsphilosophie und Jesus Christus. Ein besonderer Schwerpunkt stellten ethische Fragen dar. Für seine Zeit sehr besonnen sind seine Ausführungen über die Stellung Jesu zum Krieg aus dem Jahr 1917 in der zweiten, überarbeiteten Auflage seines zuerst 1903 erschienenen Buches über die „Die Ethik Jesu“, die auf das damals übliche Pathos verzichten. Das Buch wurde ins Schwedische und Japanische übersetzt. Neben der wissenschaftlichen philosophisch-theologischen Arbeit war Grimm auch die Weitergabe seiner Erträge wichtig: Seit dem Wintersemester 1897/98 lehrte er Theologie am Allgemeinen Vorlesungswesen und vom Wintersemester 1908/09 bis zum Sommersemester 1919 am neu gegründeten Kolonialinstitut, an dem Beschäftigte – auch Missionare – für den Dienst in den Kolonien ausgebildet wurden. Sehr gut besucht waren vor allem Grimms Vorlesungen über Weltanschauungsfragen. 1920 wurde er emeritiert und trat von seinem Amt als Senior zurück. Seinen Ruhestand verbrachte G. auf seinem Landsitz in Emmelndorf bei Hittfeld, wo er sich philosophischen Arbeiten widmete und zwei Bücher vorlegte: 1922 erschien „Die zwei Wege im religiösen Denken“, 1928 „Das Sittliche. Eine Weiterführung des Kantischen Grundgedankens“.

Die liberale Grundhaltung an St. Nikolai wurde fortgesetzt mit Heinz Beckmann, der von 1920 bis 1939 Hauptpastor an St. Nikolai war. Als Prediger war Beckmann sehr beliebt; er sprach nicht über Perikopen, sondern über ganze biblische Bücher im Zusammenhang, um die Gemeinde in die Bibel einzuführen. Er selbst bezeichnete sich als einen „liberalen Biblizisten“. Er wollte nichts anderes sein als einer, der die Bibel kannte, auf sie hörte und sie seiner Gemeinde auslegte. Jeweils dienstags abends hielt Beckmann zudem Vorlesungen über das Alte und das Neue Testament. Beckmann war Vorsitzender des Ortsausschusses des Evangelisch-Sozialen Kongresses und bereitete die Tagung 1927 in Hamburg vor. Als Theologe widmete Beckmann sich vor allem ethischen und religionsphilosophischen Problemen und behandelte vielfach Grenzgebiete der Theologie und der Literatur. Zentrales Thema war für ihn das Alte Testament, dem er sich von der religionswissenschaftlichen Seite zuwandte. Wie seine Schwester, die Oberschulrätin und Vorkämpferin für die Gleichberechtigung der Frauen, Emmy Beckmann (1880-1967), vertrat Beckmann in seiner Theologie liberale und in der Politik demokratische Überzeugungen; er gehörte der Staatspartei an. Beckmann setzte sich in den zwanziger Jahren insbesondere dafür ein, daß auch Frauen nach dem Theologiestudium beide kirchliche Examina ablegen und in den kirchlichen Dienst übernommen werden konnten. Mit seiner Unterstützung gelang es, 1927 ein Pfarramtshelferinnen-Gesetz durchzusetzen, das den Theologinnen nach Ablegung beider Examina eine Tätigkeit mit eingeschränkten Rechten ermöglichte. An seine eigene Gemeinde holte er 1926 aus Wiesbaden Margarete Braun (1893-1966), die in Hamburg das zweite Examen ablegen und bis 1934 als Pfarramtshelferin an St. Nikolai arbeiten konnte, bevor sie in die Krankenhaus- und Mädchenanstaltsseelsorge versetzt wurde.

Nach verschiedenen erfolglosen Bewerbungen erhielt Paul Schütz 1940 die Stelle des Hauptpastors an der liberalen St. Nikolai-Kirche, an der er zwölf Jahre tätig war. Die Wirksamkeit des neuen Hauptpastors konnte sich zunächst nicht entfalten, da er bereits im Frühjahr 1941 eingezogen wurde und sich nicht vom Kriegsdienst freistellen lassen wollte. Ab 1946 war Paul Schütz wieder mit der Aufbauarbeit in seiner Gemeinde beschäftigt und lehrte zugleich am Allgemeinen Vorlesungswesen der Universität Hamburg sowie am Kirchlichen Vorlesungswerk der Evangelisch-lutherischen Kirche im hamburgischen Staate und als hauptamtlicher Dozent – neben dem Hauptpastorat – an der 1948 gegründeten Kirchlichen Hochschule Hamburg, wo ihm 1950 der Titel „Professor der Theologie an der Kirchlichen Hochschule Hamburg“ verliehen wurde. 1952 ließ sich Paul Schütz aufgrund von Bekenntnisdifferenzen in den Ruhestand versetzen und verzichtete auf seine Professur. Er fühlte sich nicht mehr an die christozentrisch ausgerichteten reformatorischen Bekenntnisschriften gebunden, sondern in erster Linie an die altkirchliche Trinitätslehre. Er argumentierte gegen die besondere Konzentration des reformatorischen Bekenntnisses auf Jesus Christus im dreifachen „sola“: Das „sola scriptura“ – allein die Schrift – mache ausschließlich die Bibel zur Norm des Glaubens, d.h. losgelöst von Tradition und Kirche. Das „sola gratia“ – allein aus Gnaden – sei begründet auf dem „solus Christus“, der Grundformel der reformatorischen Theologie. Er sah hier eine Reduzierung der Theologie zur Christologie; Herkunft und Zukunft der Welt gerieten aus dem Blickfeld einer Theologie, die sich ausschließlich auf die Rettung des einzelnen Sünders konzentriert. Paul Schütz dagegen sah das Reich Gottes nur durch die in der Alten Kirche besonders betonte Trinität, durch Gott Vater, Sohn und Heiligen Geist, kommen und konzentrierte sich in seiner Theologie auf diese Dreieinigkeit. Nach seinem Ausscheiden aus dem aktiven kirchlichen Dienst zogen Paul Schütz und seine Frau 1953 nach Söcking bei Starnberg in Oberbayern. Paul Schütz gilt neben Karl Barth, Rudolf Bultmann und Paul Tillich als einer der bedeutendsten Theologen des 20. Jahrhunderts.